Известно, что протеолитические ферменты играют значительную роль в различных физиологических процессах: деградации запасных белков, в посттрансляционном процессинге белков, активации неактивных предшественников физиологически активных белков и пептидов, участвуют в процессах секреции, транспорта, адаптации клеточного метаболизма к изменениям внешней среды, в осуществлении защитных функций. Наряду с причинами физиологического характера интерес к протеолитическим ферментам обусловлен еще и тем, что они являются удобным объектом для изучения структуры белков, активных центров ферментов, механизмов регуляции ферментативной активности, других важных вопросов энзимологии и белковой химии. С практической точки зрения интерес к протеолитическим ферментам связан с их непосредственным участием в процессах, протекающих при хранении и переработке растительного сырья, а также применением препаратов протеаз в различных отраслях: сельском хозяйстве, пищевой промышленности, медицине. На современном этапе приоритетами любой пищевой технологии является сохранение нативных свойств биологически ценных компонентов сырья, обладающих лечебно-профилактическими свойствами, и модификация пищевого сырья, в том числе и растительного, с целью получения компонентов с определенными технологическими и функциональными свойствами. В настоящее время наибольшее распространение получили методы ферментативной модификации зернового сырья с использованием микробных ферментных препаратов протеолитического и целлюлолитичесого действия. В то же время исследование собственных протеолитических ферментов, их выделение и очистка, с целью их применения для модификации эндогенных белков, к которым они проявляют наибольшее сродство, представляется весьма интересной задачей, в плане использования всего биопотенциала зерна и “экологичности” получаемых продуктов. Такое исследование неразрывно сопряжено с изучением белковых ингибиторов протеиназ, которые традиционно рассматривались лишь как антиалиментарные компоненты сырья и пищевых продуктов, но представляют исключительный интерес как фактор регуляции процесса протеолиза, не только in vivo, но и in vitro. В статье приведены экспериментальные данные по выделению, частичной очистке и характеристике протеолитических ферментов зерна тритикале, действующих в кислой нейтральной и щелочной областях рН. Показано, что кислые и нейтральные протеиназы зерна тритикале являются ферментами тиолового типа, поскольку активируются цистеином и ингибируются п-хлормеркурий бензоатом - специфическим ингибитором тиоловых ферментов. Щелочные протеиназы относятся к сериновым протеиназам, поскольку ингибируются специфическими ингибиторами сериновых ферментов - диизопропил-фторфосфатом и фенилметилсульфонилфторидом. Методом гель-хроматографии определена молекулярная масса протеиназ зерна тритикале: кислые - 75000 Да, нейтральные - 250000 Да, щелочные - 50000 Да. Предложена схема выделения и очистки белковых ингибиторов эндогенных протеиназ из зерна тритикале. Показана их способность подавлять активность собственных протеиназ и трипсина. Методом гель-хроматографии проведено разделение ингибиторов трипсина и щелочных протеиназ тритикале (с молекулярной массой 30000 ÷ 35000 Да) и ингибиторов кислых и нейтральных протеиназ тритикале (с молекулярной массой 15000 ÷ 20000 Да). Частично очищенных препараты протеиназ и их белковых ингибиторов, полученные по предложенным схемам в дальнейшем могут быть использованы для ферментативной модификации растительных белков и регуляции процессов протеолиза в различных пищевых технологиях, использующих зерновое сырье.
It is known, that proteolytic enzymes play a significant role in various physiological processes: the degradation of reserve proteins, the post-translational process of proteins, the activation of inactive precursors of physiologically active proteins and peptides, participate in the processes of secretion, transport, adaptation of cellular metabolism to changes in the environment. Along with the reasons for the physiological character, interest in proteolytic enzymes is also due to the fact that they are a convenient object for studying the structure of proteins, active enzyme centers, mechanisms for the regulation of enzymatic activity, other important issues of enzymology and protein chemistry. From a practical point of view, interest in proteolytic enzymes is associated with their direct participation in processes that take place during the storage and processing of plant raw materials, as well as the use of protease preparations in various sectors: agriculture, food industry, medicine. At the present stage, the priority of any food technology is the preservation of the native properties of biologically valuable components of raw materials that possess therapeutic and prophylactic properties and the modification of food raw materials, including vegetable raw materials, in order to obtain components with certain technological and functional properties. Currently, the most widely used methods of enzymatic modification of grain raw materials using microbial enzyme preparations of proteolytic and cellulolytic action. At the same time, the study of their own proteolytic enzymes, their isolation and purification, with the aim of using them to modify the endogenous proteins to which they show the greatest affinity, seems to be a very interesting task, in terms of using the entire grain biopotential and ecofriendly products. Such a study is inextricably linked with the study of protein protease inhibitors, which have traditionally been considered only as antialimentary components of raw materials and food products, but are of exceptional interest as a factor in the regulation of the proteolysis process, only in vivo, but also in vitro. The article presents experimental data on the isolation, partial purification and characterization of proteolytic enzymes of triticale grain acting in acidic neutral and alkaline pH regions. It is shown that acid and neutral proteinases of triticale grain are thiol type enzymes, since they are activated by cysteine and is inhibited p-chloromercuriumbenzoate, a specific inhibitor of thiol enzymes. Alkaline proteinases belong to serine proteinases because they are inhibited by specific inhibitors of serine enzymes: diisopropylfluorophosphate and phenylmethylsulfonyl fluoride. The molecular mass of triticale grain proteinases was determined by gel chromatography: acidic - 75000 Da, neutral - 250000 Da, alkaline - 50000 Da. A scheme is proposed for the isolation and purification of protein inhibitors of endogenous proteinases from triticale grain. Their ability to inhibit the activity of their own proteinases and trypsin is shown. The separation of inhibitors of trypsin and alkaline proteinases with triticale (with a molecular weight of 30000 ÷ 35000 Da) and inhibitors of acidic and neutral proteinases of triticale (molecular weight 15000 ÷ 20000 Da) was carried out by gel chromatography. Partially purified proteinase preparations and their protein inhibitors obtained by the proposed schemes can be used subsequently for enzymatic modification of plant proteins and regulation of proteolysis processes in various food technologies using grain raw materials.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.