Введение

spfp

Хранение и переработка сельхозсырья

Storage and Processing of Farm Products

2072-96692658-767X

РОСБИОТЕХ

10.36107/spfp.2025.4.679

spfp-679

Research Article

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

BIOTECHNOLOGICAL AND MICROBIOLOGICAL ASPECTS

Селекция технологически ценных штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis: применение биохимических методов, MALDI-TOF MS и оценка пробиотических свойств перспективного образца

The Isolation of Technogenic Strains of Lactococcus lactis Subspecies lactis: Using Biological Techniques, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) and Assessment of the Probiotic Potential of a Promising Strain

https://orcid.org/0000-0002-0015-446X

Вольнова

Екатерина Романовна

Volnova

Ekaterina R.

и.о. заведущего кафедрой "Биотехнология и биоорганический синтез", кандидат технических наук

volnovaer@mgupp.ru

https://orcid.org/0000-0001-6077-5957

Каночкина

Мария Сергеевна

Kanochkina

Maria S.

к.т.н., доцент кафедры «Биотехнология и технология продуктов биоорганического синтеза»

kanoch@yandex.ru

Российский биотехнологический университетРоссияRussian Biotechnological UniversityRussian Federation

Рос сийский биотехнологический университетРоссияRussian Biotechnological UniversityRussian Federation

2025

07022026

3345576

2026

Вольнова Е.Р., Каночкина М.С.

Volnova E.R., Kanochkina M.S.

Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.

This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.

https://www.spfp-mgupp.ru/jour/article/view/679

Введение

Введение: Несмотря на широкое использование молочнокислых бактерий в пищевой промышленности, остается недостаточно изученным комплексный характеристический профиль отдельных пробиотических штаммов, включая их идентификацию, биохимические свойства и антагонистическую активность.

Цель

Цель: Провести селекцию и комплексно охарактеризовать штамм Lactococcus lactis subsp. lactis № 15 по морфологическим, физиологическим и биохимическим показателям, а также оценить его пробиотический потенциал и устойчивость к стрессовым факторам с целью выявления перспективных штаммов, обладающих оптимальными технологическими свойствами для производства кисломолочных продуктов.

Материалы и методы

Материалы и методы: Для идентификации штамма Lactococcus lactis subsp. lactis № 15 использовали метод MALDI-TOF MS, а функциональные свойства оценивали с помощью биохимических тестов API, посредством оценки ферментативной активности, а также исследований антагонистической активности в отношении патогенных микроорганизмов. Устойчивость к стрессам моделировали in vitro в средах, имитирующих желудочно-кишечный тракт.

Результаты

Результаты: Штамм продемонстрировал высокую жизнеспособность, активность ферментов β-галактозидазы и других ключевых гидролитических ферментов, выраженную антагонистическую активность против Staphylococcus aureus ВКПМ № 6646 и Klebsiella aerogenes ВКПМ № 13214, а также устойчивость к низкому pH и желчным солям.

Выводы

Выводы: Результаты исследования подтверждают перспективность использования Lactococcus lactis subsp. lactis № 15 в производстве пробиотических кисломолочных продуктов с улучшенными функциональными и технологическими характеристиками. Полученные данные могут быть применены для разработки инновационных бактериальных заквасок с высоким уровнем безопасности и эффективности в пищевой промышленности.

Introduction

Introduction: Research into lactic acid bacteria, which are widely used in the food industry, has revealed a lack of information regarding the intricate characteristics of individual probiotic strains, including their identification, elucidation of biochemical properties, and evaluation of antagonistic activity.

Purpose

Purpose: To isolate and comprehensively characterize Lactococcus lactis strain No. 15 in terms of its morphological, physiological, and biochemical properties, as well as to assess its probiotic potential and stress tolerance, in order to identify a novel strain with optimal functional characteristics for application in the production of fermented dairy products.

Materials and Methods

Materials and Methods: To achieve these goals, we used MALDI-MS to identify the strain, then evaluated its functional characteristics through a series of biochemical tests including API testing, enzyme activity assessment, and antagonist activity against pathogenic microorganisms. We also conducted in vitro modeling of stress resistance under simulated gastrointestinal conditions.

Results

Results: The strain demonstrated remarkable viability and exhibited robust beta-galactosidase and other important hydrolytic enzyme activities. Additionally, it showed a strong antagonistic effect against Staphylococcus aureus VKPM No. 6646 and Klebsiella aerogenes VKMP No. 13214, as well as resistance to low pH and bile salts.

Conclusion

Conclusion: Lactococcus lactis subsp. lactis № 15 has potential for use in the production of fermented dairy products with enhanced functional and technological properties. The data collected can serve as a basis for the development of new bacterial starters with high safety and efficacy in food production.

микроорганизмыпробиотические культурымасс-спектрометрияMALDI-TOFмолочнокислые бактерииидентификация микроорганизмовпробиотический потенциалLactococcus lactis subsp. lactis

microorganismsprobiotic culturesmatrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF)large-scale identification of microorganismsprobioticsantibioticsLactococcus lactis subspecies lactis

References1

Бибарсова, А. А., Семенова, Е. Ф., Золкина, Н. Г., Моисеева, И. Я., Степанова, А. П., & Ловцова, Л. Б. (2022). Штамм бактерий Lactococcus lactis subsp. cremoris 36 RCAM 05396, используемый при производстве кисломолочных диетических продуктов (патент РФ № RU2780155C1). Пензенский государственный университет. https://patents.google.com/patent/RU2780155C1/ru

Литература/ references

Грицкевич, Е. Р., Бученков, И. Э., & Иконникова, Н. В. (2017). Лабораторный практикум по микробиологии: пособие. Минск: ИВЦ Минфина.

Бибарсова, А. А., Семенова, Е. Ф., Золкина, Н. Г., Моисеева, И. Я., Степанова, А. П., & Ловцова, Л. Б. (2022). Штамм бактерий Lactococcus lactis subsp. cremoris 36 RCAM 05396, используемый при производстве кисломолочных диетических продуктов (патент РФ № RU2780155C1). Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Пензенский государственный университет». https://patents.google.com/patent/RU2780155C1/ru

Гусева, Т. Б., Солдатова, С. Ю., & Караньян, О. М. (2021). Органолептическая оценка молочных консервов: особенности проведения и интерпретации результатов. Товаровед продовольственных товаров, (10), 726–729. https://doi.org/10.33920/igt-01-2110-01

Bibarsova, A. A., Semenova, E. F., Zolkina, N. G., Moiseeva, I. Ya., Stepanova, A. P., & Lovtsova, L. B. (2022). Shtamm bakterii Lactococcus lactis subsp. cremoris 36 RCAM 05396, ispol'zuemyi pri proizvodstve kislomolochnykh dieteticheskikh produktov [Strain of bacteria Lactococcus lactis subsp. cremoris 36 RCAM 05396 used in the production of fermented milk dietary products] (Patent No. RU2780155C1). Federal'noe gosudarstvennoe biudzhetnoe obrazovatel'noe uchrezhdenie vysshego obrazovaniia "Penzenskii gosudarstvennyi universitet". https://patents.google.com/patent/RU2780155C1/ru. (In Russ.)

Китаевская С.В. (2015). Изучение способности молочнокислых бактерий продуцировать липолитические ферменты. Вестник Казанского технологического университета, 18(18), 256–258.

Грицкевич, Е. Р., Бученков, И. Э., & Иконникова, Н. В. (2017). Лабораторный практикум по микробиологии: пособие (113 с.). Минск: ИВЦ Минфина. http://elib.bsu.by/handle/123456789/189410

Кущ, И. В., Баиров, А. Л., & Удавлиев, Д. И. (2021). Современные методы выделения и идентификации микроорганизмов в пищевых продуктах. Ветеринарная патология, 4(78), 49–56. https://doi.org/10.25690/VETPAT.2021.91.53.002

Gritskevich, E. R., Bucenkov, I. E., & Ikonnikova, N. V. (2017). Laboratornyi praktikum po mikrobiologii: posobie [Laboratory workshop in microbiology: a manual] (113 p.). Izdatel'skii tsentr Minfina. http://elib.bsu.by/handle/123456789/189410. (In Russ.)

Петров, А. Н., Матвеенко, А. С., & Стрижко, М. Н. (2013). Исследование штаммов микроорганизмов, обладающих β-галактозидазной активностью, и их анализ. Техника и технология пищевых производств, (1), 16–20.

Angelakis, E., Million, M., Henry, M. and Raoult, D. (2011), Rapid and Accurate Bacterial Identification in Probiotics and Yoghurts by MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Food Science, 76, M568–M572. https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2011.02369.x

Guseva, T. B., Soldatova, S. Yu., & Karanyan, O. M. (2021). Organolepticheskaia otsenka molochnykh konservov: osobennosti provedeniia i interpretatsii rezul'tatov [Organoleptic evaluation of canned milk products: features of conducting and interpreting results]. Tovaroved prodovol'stvennykh tovarov, (10), 726–729. https://doi.org/10.33920/igt-01-2110-01. (In Russ.)

Barbosa, J. P., Trindade, D. P. A., Martins, E. M. F., & Tette, P. A. S. (2022). Lactic acid bacteria isolated from fruits: A review on methods for evaluation of probiotic potential. Journal of Food and Nutrition Research, 10(10), 711–726. https://doi.org/10.12691/jfnr-10-10-9.

Bintsis T. (2018). Lactic acid bacteria as starter cultures: An update in their metabolism and genetics. AIMS Microbiology, 4(4), 665–684. https://doi.org/10.3934/microbiol.2018.4.665

Kitaevskaia, S. V. (2015). Izuchenie sposobnosti molochnokislykh bakterii produktsirovat' lipoliticheskie fermenty [Study of the ability of lactic acid bacteria to produce lipolytic enzymes]. Vestnik Kazanskogo Tekhnologicheskogo Universiteta, 18(18), 256–258. (In Russ.)

Cotter, P. D., Hill, C., & Ross, R. P. (2005). Bacteriocins: developing innate immunity for food. Nature Reviews Microbiology, 3(10), 777–788. https://doi.org/10.1038/nrmicro1273

Кущ, И. В., Баиров, А. Л., & Удавлиев, Д. И. (2021). Современные методы выделения и идентификации микроорганизмов в пищевых продуктах. Ветеринарная патология, 4 (78), 49-56. https://doi.org/10.25690/VETPAT.2021.91.53.002

De Chiara, I., Marasco, R., Della Gala, M., Fusco, A., Donnarumma, G., & Muscariello, L. (2024). Probiotic properties of Lactococcus lactis Strains isolated from natural whey starter cultures. Foods, 13(6), 957. https://doi.org/10.3390/foods13060957

Kushch, I. V., Bairov, A. L., & Udavliev, D. I. (2021). Sovremennye metody vydeleniia i identifikatsii mikroorganizmov v pishchevykh produktakh [Modern methods of isolation and identification of microorganisms in food products]. Veterinarnaia patologiia, 4(78), 49–56. https://doi.org/10.25690/VETPAT.2021.91.53.002. (In Russ.)

Dec, M., Puchalski, A., Urban-Chmiel, R., Wernicki A. (2016). 16S-ARDRA and MALDI-TOF mass spectrometry as tools for identification of Lactobacillus bacteria isolated from poultry. BMC Microbiology 16, 105(2016). https://doi.org/10.1186/s12866-016-0732-5

Мудрецова-Висс, К. А., Дедюхина, В. П., & Масленникова, Е. В. (2014). Основы микробиологии: учебник (5-е изд., исправленное, пересмотренное и дополненное). Москва: ИНФРА-М.

De Vuyst, L., & Leroy, F. (2007). Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 13(4), 194–199. https://doi.org/10.1159/000104752

Mudretsova-Viss, K. A., Dediukhina, V. P., & Maslennikova, E. V. (2014). Osnovy mikrobiologii: uchebnik [Fundamentals of microbiology: textbook] (5th ed., ispr. i dop.). INFRA-M. (In Russ.)

Dunne, C., O'Mahony, L., Murphy, L., Thornton, G., Morrissey, D., O'Halloran, S., Feeney, M., Flynn, S., Fitzgerald, G., Daly, C., Kiely, B., O'Sullivan, G. C., Shanahan, F., & Collins, J. K. (2001). In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings. American Journal of Clinical Nutrition, 73(2 Suppl), 386S–392S. https://doi.org/10.1093/ajcn/73.2.386s

EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ), Koutsoumanis, K., Allende, A., Alvarez-Ordóñez, A., Bolton, D., Bover-Cid, S., Chemaly, M., Davies, R., De Cesare, A., Hilbert, F., Lindqvist, R., Nauta, M., Peixe, L., Ru, G., Simmons, M., Skandamis, P., Suffredini, E., Cocconcelli, P. S., Fernández Escámez, P. S., Maradona, M. P., Querol, A., Sijtsma, L., Suarez, J. E., Sundh, I., Vlak, J., Barizzone, F., Hempen, M., Correia, S., & Herman, L. (2022). Update of the list of QPS-recommended microbiological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 16: Suitability of taxonomic units notified to EFSA until March 2022. EFSA Journal, 20(7), e07408. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2022.7408

Petrov, A. N., Matveenko, A. S., & Strizhko, M. N. (2013). Issledovanie shtammov mikroorganizmov, obladaiuschikh β-galaktosidaznoi aktivnost'iu, i ikh analiz [Study of microorganism strains with β-galactosidase activity and their analysis]. Tekhnika i tekhnologiia pishchevykh proizvodstv, (1), 16–20. https://naukaru.ru/ru/nauka/article/27823/view. (In Russ.)

Fenster, K., Freeburg, B., Hollard, C., Wong, C., Rønhave Laursen, R., & Ouwehand, A. C. (2019). The Production and delivery of probiotics: A review of a practical approach. Microorganisms, 7(3), 83. https://doi.org/10.3390/microorganisms7030083

Hammes, W. P., & Hertel, C. (2014). The genera Lactococcus and Pediococcus. In M. Dworkin (Ed.), The Prokaryotes (pp. 177–237). Springer.

Clinical and Laboratory Standards Institute. (2022). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing (32nd ed.). CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute.

Hussain, N., Tariq, M., Saris, P.E.J., & Zaidi, A. (2021) Evaluation of the probiotic and postbiotic potential of lactic acid bacteria from artisanal dairy products against pathogens. Journal of Infection in Developing Countries, 15, 102–112. https://doi.org/10.3855/jidc.13404

Cotter, P. D., Hill, C., & Ross, R. P. (2005). Bacteriocins: developing innate immunity for food. Nature Reviews Microbiology, 3(10), 777–788. https://doi.org/10.1038/nrmicro1273.

Kaur Sidhu, P., & Nehra, K. (2021). Bacteriocins of lactic acid bacteria as potent antimicrobial peptides against food pathogens. IntechOpen. https://doi.org/10.5772/intechopen.95747

Courvalin, P. (2006). Vancomycin resistance in gram-positive cocci. Clinical Infectious Diseases, 42(Supplement_1), S25–S34. https://doi.org/10.1086/491711.

Khemariya, P., Singh, S., Nath, G., & Gulati, A. K. (2017). Probiotic Lactococcus lactis: A review. Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology, 5(6), 556–562. https://doi.org/10.24925/turjaf.v5i6.556-562.690

Kimoto-Nira, H., Suzuki, C., Sasaki, K., Kobayashi, M., & Mizumachi, K. (2010). Survival of a Lactococcus lactis strain varies with its carbohydrate preference under in vitro conditions simulated gastrointestinal tract. International Journal of Food Microbiology, 143(3), 226–229. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2010.07.033

Kondrotiene, K., Zavistanaviciute, P., Aksomaitiene, J., Novoslavskij, A., & Malakauskas, M. (2024). Lactococcus lactis in dairy fermentation-health-promoting and probiotic properties. Fermentation, 10(1), 16. https://doi.org/10.3390/fermentation10010016

EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ), Koutsoumanis, K., Allende, A., Alvarez-Ordóñez, A., Bolton, D., Bover-Cid, S., Chemaly, M., Davies, R., De Cesare, A., Hilbert, F., Lindqvist, R., Nauta, M., Peixe, L., Ru, G., Simmons, M., Skandamis, P., Suffredini, E., Cocconcelli, P. S., Fernández Escámez, P. S., Maradona, M. P., Querol, A., Sijtsma, L., Suarez, J. E., Sundh, I., Vlak, J., Barizzone, F., Hempen, M., Correia, S., & Herman, L. (2022). Update of the list of QPS-recommended microbiological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 16: suitability of taxonomic units notified to EFSA until March 2022. EFSA Journal, 20(7), e07408. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2022.7408.

Lauková, A., Maďar, M., Zábolyová, N., Troscianczyk, A., & Pogány Simonová, M. (2024). Fortification of goat milk yogurts with encapsulated postbiotic active Lactococci. Life, 14(9), 1147. https://doi.org/10.3390/life14091147

European Commission. (2022). Guidance on the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human or veterinary importance. Official Journal of the European Union.

Mathur, S., & Singh, R. (2005). Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria-a review. International Journal of Food Microbiology, 105(3), 281–295. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2005.03.008

Fenster, K., Freeburg, B., Hollard, C., Wong, C., Rønhave Laursen, R., & Ouwehand, A. C. (2019). The Production and Delivery of Probiotics: A Review of a Practical Approach. Microorganisms, 7(3), 83. https://doi.org/10.3390/microorganisms7030083.

Mafe, A.N., Iruoghene Edo, G., Akpoghelie, P.O., Gaaz, T., S., Yousif E., Zainulabdeen K., Isoje E. F., Igbuku U. A., Opiti R. A., Garba Y., Essaghah A. E. A., Ahmed D. S., Umar H. (2025). Probiotics and food bioactives: Unraveling their impact on gut microbiome, inflammation, and metabolic health. Probiotics & Antimicrob Proteins, 17, 1851–1892. https://doi.org/10.1007/s12602-025-10452-2

Hammes, W. P., & Hertel, C. (2014). The genera Lactococcus and Pediococcus. In M. Dworkin (Ed.), The Prokaryotes (pp. 177–237). Springer.

Minj, J., Chandra, P., Paul, C., & Sharma, R. K. (2020). Bio-functional properties of probiotic Lactobacillus: current applications and research perspectives. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 61(13), 2207–2224. https://doi.org/10.1080/10408398.2020.1774496

Nagy, E., & Schuetz, A. (2018). Advancing MALDI-TOF MS applications in anaerobic bacteriology. Anaerobe, 54, 189–190. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2018.10.010

Mathur, S., & Singh, R. (2005). Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria--a review. International Journal of Food Microbiology, 105(3), 281-295. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2005.03.008.

Noun, M., Akoumeh, R., & Abbas, I. (2022). Cell and tissue imaging by TOF-SIMS and MALDI-TOF: An overview for biological and pharmaceutical analysis. Microscopy and Microanalysis, 28(1), 1–26. https://doi.org/10.1017/S1431927621013593

Reynolds, P. E. (1989). Structure, biochemistry and mechanism of action of glycopeptide antibiotics. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 8(11), 943–950. https://doi.org/10.1007/BF01967563

Nagy, E., & Schuetz, A. (2018). Advancing MALDI-TOF MS applications in anaerobic bacteriology. Anaerobe, 54, 189–190. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2018.10.010.

Saarela, M., Mogensen, G., Fondén, R., Mättö, J., & Mattila-Sandholm, T. (2000). Probiotic bacteria: Safety, functional and technological properties. Journal of Biotechnology, 84(3), 197–215. https://doi.org/10.1016/s0168-1656(00)00375-8

Sanca, F. M. M., Blanco, I. R., Dias, M., Moreno, A. M., Martins, S. M. M. K., Stephano, M. A., Mendes, M. A., Mendonça, C. M. N., Pereira, W. A., Azevedo, P. O. S., Gierus, M., & Oliveira, R. P. S. (2023). Antimicrobial activity of peptides produced by Lactococcus lactis subsp. lactis on swine pathogens. Animals, 13(15), 2442. https://doi.org/10.3390/ani13152442

Shah, A. B., Baiseitova, A., Zahoor, M., Ahmad, I., Ikram, M., Bakhsh, A., Shah M. A., Ali I., Idress M., Ullah R., Al-Zharani, M. (2024). Probiotic significance of Lactobacillus strains: А comprehensive review on health impacts, research gaps, and future prospects. Gut Microbes, 16(1). https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2431643

Staronenkova, M.A., Chikhalina, T.V., & Namsaraev, Z.B. (2023). Russian market of enzyme preparations and microorganisms for the food industry. Nanotechnol Russia, 18, 475–479. https://doi.org/10.1134/S2635167623700349.

Shah, A. B., Baiseitova, A., Zahoor, M., Ahmad, I., Ikram, M., Bakhsh, A., … Al-Zharani, M. (2024). Probiotic significance of Lactobacillus strains: a comprehensive review on health impacts, research gaps, and future prospects. Gut Microbes, 16(1). https://doi.org/10.1080/19490976.2024.2431643.

Sun, W., Shahrajabian, M. H., & Lin, M. (2022). Research progress of fermented functional foods and protein factory-microbial fermentation technology. Fermentation, 8(12), 688. https://doi.org/10.3390/fermentation8120688

Staronenkova, M.A., Chikhalina, T.V. & Namsaraev, Z.B. Russian Market of Enzyme Preparations and Microorganisms for the Food Industry. Nanotechnol Russia 18, 475–479 (2023). https://doi.org/10.1134/S2635167623700349.

Tang, T., & Leisner, J. (2024). Bacteriocin antagonistic potentials of Lactococcus cremoris and Lactococcus lactis isolates from different habitats. Probiotics and Antimicrobial Proteins, 1–12. https://doi.org/10.1007/s12602-024-10361-w

Sun, W., Shahrajabian, M. H., & Lin, M. (2022). Research Progress of Fermented Functional Foods and Protein Factory-Microbial Fermentation Technology. Fermentation, 8(12), 688. https://doi.org/10.3390/fermentation8120688.

Tenea, G. N., Hurtado, P., & Ortega, C. (2018). Inhibitory effect of substances produced by native lactococcus lactis strains of tropical fruits towards food pathogens. Preventive Nutrition and Food Science, 23(3), 260–268. https://doi.org/10.3746/pnf.2018.23.3.260

Venegas-Ortega, M.G., Flores-Gallegos, A.C., Martínez-Hernández, J.L., Aguilar, C.N. and Nevárez-Moorillón, G.V. (2019). Production of bioactive peptides from lactic acid bacteria: A sustainable approach for healthier foods. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 18, 1039–1051. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12455

Walsh, C. T., Fisher, S. L., Park, I. S., Prahalad, M., & Wu, Z. (1996). Bacterial resistance to vancomycin: Five genes and one missing hydrogen bond tell the story. Chemistry & Biology, 3(1), 21–28. https://doi.org/10.1016/s1074-5521(96)90079-4.

Wu, F., Xie, X., Du, T., Jiang, X., Miao, W., & Wang, T. (2023). Lactococcus lactis, a bacterium with probiotic functions and pathogenicity. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 39(12), 325. https://doi.org/10.1007/s11274-023-03771-5.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.