Киллерные токсины аскомицетовых дрожжей, подавляющие фитопатогенные грибы Botrytis cinerea

Введение: Из года в год растет ущерб, причиняемый патогенными микроорганизмами сельскому хозяйству. Использование пестицидов может негативно сказываться на качестве сырья и здоровье потребителей. Односторонний подход в решении данного вопроса не приводит к положительным результатам. Киллерные токсины (КТ) дрожжей представляют значительный интерес для биотехнологии в качестве препаратов, подавляющих активность патогенов.

Целью: данного исследования является проведение скрининга штаммов аскомицетовых дрожжей из коллекции Национального биоресурсного центра Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт», проявляющих наибольшую киллерную активность по отношению к фитопатогенным грибам вида Botrytis cinerea, а также определение факторов, влияющих на ее эффективность.

Материалы и методы: Определение активности КТ проводилось на тонком агаре на полной дрожжевой среде YPD с добавлением 0,5 мл/л 88 % раствора молочной кислоты, pH = 4,5. Значение водородного показателя 4,5 выбрано как оптимальное для большинства исследуемых ранее видов дрожжей. Также проведены тесты при различных значениях pH и температуры. Для поддержания различных температур культивирования дрожжей использовался термостат ТС-1/80 (Смоленское СКТБ СПУ, Смоленск, Россия). Контроль уровня pH производился при помощи индикаторных полосок высокой точности Diversey-MN92110 (Macherey-Nagel, Германия). Для подтверждения видовой принадлежности дрожжей методом микроскопирования использовался микроскоп биологический Микромед 2 (2–20 inf.) (ООО «Наблюдательные приборы», Санкт-Петербург,Россия).

Результаты: Наибольшие зоны подавления роста Botrytis cinerea показаны для штаммов Schwanniomyces occidentalis Y1-627,Y-1628, Y-1629,Y-1638, Y-1640, Y-1641, Metschnikowia pulcherrima Y-3698. Также небольшие зоны подавления наблюдали у штаммов Cyberlindnera mrakii Y-1211, Wickerhamomyces anomalus Y-201, Y-3836, Y-4562, Y-1182, Debaryomyces hansenii Y-1681. При проведении теста на остальных штаммах действие КТ не выявлено.

Выводы: В настоящем исследовании обнаружены штаммы киллерных дрожжей из коллекции БРЦ ВКПМ, эффективные против Botrytis cinerea F 1006, что имеет потенциальное значение для разработки и использования их в качестве средств биоконтроля.

1. Baeza, M. E., Sanhueza, M. A., & Cifuentes, V. H. (2008). Occurrence of killer yeast strains in industrial and clinical yeast isolates. Biological Research, 41(2), 173-182. https://doi.org/10.4067/S0716-97602008000200007

2. Banjara, N., Nickerson, K. W., Suhr, M. J., & Hallen-Adams, H. E. (2016). Killer toxin from several food-derived Debaryomyces hansenii strains effective against pathogenic Candida yeasts. International Journal of Food Microbiology, 222, 23-29. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2016.01.016

3. Becker, B., & Schmitt, M. J. (2017). Yeast killer toxin k28: Biology and unique strategy of host cell intoxication and killing. Toxins, 9(10), Article 333. https://doi.org/10.3390/toxins9100333

4. Belda, I., Ruiz, J., Alonso, A.,, Marquin, D., & Santos, A. (2017). The biology of Pichia membranifaciens killer toxins. Toxins, 9(4), Article 112. https://doi.org/10.3390/toxins9040112

5. Bi, K., Liang, Y., Mengiste, T., & Sharon, A. (2023). Killing softly: A roadmap of Botrytis cinerea pathogenicity. Trends in Plant Science, 28(2), 211-222. https://doi.org/10.1016/j.tplants.2022.08.024

6. Boynton, P. J. (2019). The ecology of killer yeasts: Interference competition in natural habitats. Yeast, 36(8), 473-485. https://doi.org/10.1002/yea.3398

7. Büyüksırıt, B. T., & Kuleaşan, H. (2021). A natural approach, the use of killer toxin produced by Metschnikowia pulcherrima in fresh ground beef patties for shelf life extention. International Journal of Food Microbiology, 345, Article 109154. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2021.109154

8. Büyüksırıt, B. T., & Kuleaşan, H. (2022). Purification and characterization of a Metschnikowia pulcherrima killer toxin with antagonistic activity against pathogenic microorganisms. Archives of Microbiology, 204(6), Article 337. https://doi.org/10.1007/s00203-022-02940-8

9. Cappelli, A., Ulissi, U., Valzano, M., Damiani, C., Epis, S., Gabrielli, M. G., Conti, S., Polonelli, L., Bandi, C., Favia, G., & Ricci, I. (2014). A Wickerhamomyces anomalus killer strain in the malaria vector Anopheles stephensi. PLoS One, 9(5), Article e95988. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0095988

10. Carboni, G., Fancello, F., Zara, G., Zara, S., Ruiu, L., Marova, I., Pinna, G., Budroni, M., Mannazzu, I. (2020). Production of a lyophilized ready-to-use yeast killer toxin with possible applications in the wine and food industries. International Journal of Food Microbiology, 335, Article 108883. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2020.108883

11. Chen, P. H., & Chou, J. Y. (2017). Screening and identification of yeasts antagonistic to pathogenic fungi show a narrow optimal ph range for antagonistic activity. Polish Journal of Microbiology, 66(1), 101-106. https://doi.org/10.5604/17331331.1234997

12. Comitini, F., & Ciani, M. (2011). Kluyveromyces wickerhamii killer toxin: Purification and activity towards brettanomyces/dekkera yeasts in grape must. FEMS Microbiology Letters, 316(1), 77-82. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2010.02194.x

13. Conti, S., Magliani, W., Gerloni, M., Salati, A., Dieci, E., Arseni, S., Fisicaro, P., & Polonelli, L. (1998). A transphyletic anti-infectious control strategy based on the killer phenomenon. FEMS Immunology & Medical Microbiology, 22(1-2), 151-161. https://doi.org/10.1111/j.1574-695x.1998.tb01200.x

14. De Lima, J. R., Gonçalves, L. R., Brandão, L. R., Rosa, C. A., & Viana, F. M. (2013). Isolation, identification, and activity in vitro of killer yeasts against Colletotrichum gloeosporioides isolated from tropical fruits. Journal of Basic Microbiology, 53(7), 590-599. https://doi.org/10.1002/jobm.201200049

15. De Ullivarri, F. M., Bulacios, G. A., Navarro, S. A., Lanza, L., Mendoza, L. M., & Chalón, M. C. (2020). The killer yeast Wickerhamomyces anomalus Cf20 exerts a broad anti-Candida activity through the production of killer toxins and volatile compounds. Medical Mycology, 258(8), 1102-1113. https://doi.org/10.1093/mmy/myaa011

16. Dlamini, N. R., & Dube, S. (2008). Studies on the physico-chemical, nutritional and microbiological changes during the traditional preparation of Marula wine in Gwanda, Zimbabwe. Nutrition & Food Science, 38(1), 61-69. https://doi.org/10.1108/00346650810848025

17. Farkas, Z., Márki-Zay, J., Kucsera, J., Vágvölgyi, C., Golubev, W. I., & Pfeiffer, I. (2012). Characterization of two different toxins of Wickerhamomyces anomalus (Pichia anomala) VKM Y-159. Acta Biologica Hungarica, 63(2), 277-287. https://doi.org/10.1556/abiol.63.2012.2.9

18. Freimoser, F. M., Rueda-Mejia, M. P., Tilocca, B., & Migheli, Q. (2019). Biocontrol yeasts: mechanisms and applications. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 35(10), Article 154. https://doi.org/10.1007/s11274-019-2728-4

19. Giovati, L., Ciociola, T., De Simone, T., Conti, S., & Magliani, W. (2021). Wickerhamomyces yeast killer toxins' medical applications. Toxins, 13(9), Article 655. https://doi.org/10.3390/toxins13090655

20. Grzegorczyk, M., Żarowska, B., Restuccia, C., & Cirvilleri, G. (2017). Postharvest biocontrol ability of killer yeasts against Monilinia fructigena and Monilinia fructicola on stone fruit. Food Microbiology, 61, 93-101. https://doi.org/10.1016/j.fm.2016.09.005

21. Guyard, C., Evrard, P., Corbisier-Colson, A. M., Louvart, H., Dei-Cas, E., Menozzi, F. D., Polonelli, L., & Cailliez, J. (2001). Immuno-crossreactivity of an anti-Pichia anomala killer toxin monoclonal antibody with a Williopsis saturnus var. mrakii killer toxin. Medical Mycology, 39(5), 395-400. https://doi.org/10.1080/mmy.39.5.395.400

22. Hicks, R. H., Moreno-Beltrán, M., Gore-Lloyd, D., Chuck, C. J., & Henk, D. A. (2021). The oleaginous yeast Metschnikowia pulcherrima displays killer activity against avian-derived pathogenic bacteria. Biology, 10(12), Article 1227. https://doi.org/10.3390/biology10121227

23. Karabulut, G., & Cagri-Mehmetoglu, A. (2018). Antifungal, mechanical, and physical properties of edible film containing williopsis saturnus var. saturnus antagonistic yeast. Journal of Food Science, 83(3), 763-769. https://doi.org/10.1111/1750-3841.14062

24. Klassen, R., Schaffrath, R., Buzzini, P., & Ganter, P. F. (2017). Antagonistic interactions and killer yeasts. In P. Buzzini, M.-A. Lachance, A. Yurkov (Eds.). Yeasts in natural ecosystems: Ecology (pp. 229-275). Springer. https://doi.org/10.1007/978-3-319-61575-2_9

25. Liu, G. L., Chi, Z., Wang, G. Y., Wang, Z. P., Li, Y., & Chi, Z. M. (2015). Yeast killer toxins, molecular mechanisms of their action and their applications. Critical Reviews in Biotechnology, 35(2), 222-234. https://doi.org/10.3109/07388551.2013.833582

26. Maluleke, E., Jolly, N. P., Patterton, H. G., & Setati, M. E. (2022). Antifungal activity of non-conventional yeasts against Botrytis cinerea and non-Botrytis grape bunch rot fungi. Frontiers in Microbiology, 13, Article 986229. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.986229

27. Mannazzu, I., Domizio, P., Carboni, G., Zara, S., Zara, G., Comitini, F., Budroni, M., & Ciani, M. (2019). Yeast killer toxins: From ecological significance to application. Critical Reviews in Biotechnology, 39(5), 603-617. https://doi.org/10.1080/07388551.2019.1601679

28. Mazzucco, M. B., Ganga, M. A., & Sangorrín, M. P. (2019). Production of a novel killer toxin from Saccharomyces eubayanus using agro-industrial waste and its application against wine spoilage yeasts. Antonie Van Leeuwenhoek, 112(7), 965-973. https://doi.org/10.1007/s10482-019-01231-5

29. Mehlomakulu, N. N., Setati, M. E., & Divol, B. (2014). Characterization of novel killer toxins secreted by wine-related non-Saccharomyces yeasts and their action on Brettanomyces spp. International Journal of Food Microbiology, 188, 83-91. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2014.07.015

30. Muccilli, S., Wemhoff, S., Restuccia, C., & Meinhardt, F. (2013). Exoglucanase-encoding genes from three Wickerhamomyces anomalus killer strains isolated from olive brine. Yeast, 30(1), 33-43. https://doi.org/10.1002/yea.2935

31. Ochigava, I., Collier, P. J., Walker, G. M., & Hakenbeck, R. (2011). Williopsis saturnus yeast killer toxin does not kill Streptococcus pneumoniae. Antonie van Leeuwenhoek, 99(3), 559-566. https://doi.org/10.1007/s10482-010-9524-3

32. Połomska, X., Neuvéglise, C., Zyzak, J., Żarowska, B., Casaregola, S., & Lazar, Z. (2021). New cytoplasmic virus-like elements (Vles) in the yeast Debaryomyces hansenii. Toxins, 13(9), Article 615. https://doi.org/10.3390/toxins13090615

33. Sanaa, M. A., Zeineb, M. H., Fatma, M. I., & Sanaa, S. Z. (2015). Killer toxins of Candida utilis 22 and Kluyveromyces marxianus and their potential applications as biocontrol agents. Egyptian Journal of Biological Pest Control, 25(2), 317-325.

34. Santos, A., & Marquina, D. (2011). The transcriptional response of Saccharomyces cerevisiae to proapoptotic concentrations of Pichia membranifaciens killer toxin. Fungal Genetics and Biology, 48(10), 979-989. https://doi.org/10.1016/j.fgb.2011.07.002

35. Santos, A., Marquina, D., Barroso, J., & Peinadom, J. M. (2002). Beta-D-glucan as the cell wall binding site for Debaryomyces hansenii killer toxin. Letters in Applied Microbiology, 34(2), 95-99. https://doi.org/10.1046/j.1472-765x.2002.01053.x

36. Santos, A., San Mauro, M., Abrusci, C., & Marquina, D. (2007). Cwp2p, the plasma membrane receptor for Pichia membranifaciens killer toxin. Molecular Microbiology, 64(3), 831-843. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2007.05702.x

37. Sheppard, S., & Dikicioglu, D. (2019). Dynamic modelling of the killing mechanism of action by virus-infected yeasts. Journal of the Royal Society Interface, 16(152), Article 20190064. https://doi.org/10.1098/rsif.2019.0064

38. Steel, C. C., Blackman, J. W., Schmidtke L. M. (2013). Grapevine bunch rots: impacts on wine composition, quality, and potential procedures for the removal of wine faults. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61(22), 5189-5206. https://doi.org/10.1021/jf400641r